NUOVE PROSPETTIVE
DI CHEMIOTERAPIA ANTINEOPLASTICA
CON SOSTANZE ESTRATTE DA PIANTE
FARMACOLOGICAMENTE SCONOSCIUTE
IN CAMPO ONCOLOGICO



Dott. Claudio D’Arrigo
Medico Chirurgo
Specialista in Medicina Interna e in Medicina Tropicale e Subtropicale (Roma)
Direttore Laboratorio di Ricerca Oncologica della IDI Farmaceutici

Prospects for antitumor chemotherapy using pharmacologically unknown plant extract. Experimental oncological research leads to the discovery of new weapons against cancer. The author has isolated two new antitumors substances from plants which have never been used for pharmacological purposes. The paper outlines the working hypothesis with which this result was achieved; it also discusses their presumed mechanism of action and their capacity to select tumour cells. Lasly, the author reports the results obtained in six experimental animal tumour models. Both substances showed a level of efficacy in both ascitic and solid tumours which far exceeds that of those agents currently and used in human antitumor chemotherapy.
Key words: Neoplasm, experimental.


Il problema cancro
e la ricerca farmacologica


Il "problema cancro" si fa ogni giorno più pressante. Rilievi statistici rigorosi, effettuati dapprima in Germania e poi anche in Italia, dimostrano che attualmente un caso di morte su quattro è imputabile a tumori, mentre nel 1900 la proporzione era di 1:30. La "scala del cancro" si va facendo, di decennio in decennio, sempre più ripida e la considerazione che nel contempo si sia verificato un incremento della popolazione ed un aumento della durata media della vita (è nota la maggiore incidenza dei tumori nelle classi di età più avanzate), non ci rende edotti dell’eccesso di mortalità reale rispetto alle aspettative statistiche (fig. 1).


Fig. 1. – La scala del cancro: aumento della mortalità per tumori (da Süss-Kinzel-Scribner: il Cancro, mod.).



Con Bauer possiamo concludere che l’eccesso di incremento della mortalità per cancro porta ad una sola considerazione: <<i tumori sono in aumento continuo perché in aumento continuo sono anche le cause che ne determinano l’insorgenza>> (Bauer KH: Das Krebsproblem, Berlin 1963) e ciò è in accordo con il progressivo inquinamento ambientale geo-idro-atmosferico operato dai cancerogeni prodotti continuamene dalla  civiltà umana.

    La scienza risponde all’"emergenza cancro" mediante due filoni di ricerca, la ricerca di base e la ricerca applicata.

    La ricerca di base ha, nel caso specifico, per forza di cose, tempi lunghi e risultati incerti.

    La ricerca applicata, volta pragmaticamente a risolvere il problema cancro, spinta dalla pressanza del fenomeno, si è svolta finora, seppure con dispendio di risorse ciclopiche, in maniera disordinata e, nella maggior parte dei casi, nell’assoluta assenza di un disegno logico che potesse permettere di centrare l’obiettivo.

    Nel 1956 l’Istituto Nazionale Americano dei Tumori ha dato il via ad un programma di ricerca chemioterapica per la "conquista del cancro" che ha valutato finora ben 190.000 composti chimici di sintesi, 160.000 prodotti di fermentazione, 60.000 sostanze di origine vegetale e 12.000 di altra origine (estratte da organismi marini, da insetti, ecc.) provenienti da tutto il mondo (Wood MB Jr., USA).

    Da questo immane sforzo si è riusciti ad introdurre in terapia circa 70 prodotti anticancerosi, sia pure con effetti limitati. Alla luce dei risultati raggiunti il suddetto programma di ricerca, la scoperta e messa a punto di un nuovo farmaco antitumorale può emergere dallo "screening" di 30-40.000 nuove sostanze chimiche.

    Lo "screening" indiscriminato, condotto alla cieca, ha comportato finora un enorme impiego di energie intellettuali e materiali senza sortire apprezzabili risultati dal punto di vista pratico.

    Rimane il fatto che ancora oggi, i farmaci di riconosciuta capacità chemioterapica antineoplastica, non siano più di una trentina e che i più importanti tra questi si contino sulla punta delle dita di una sola mano e che comunque siano venuti alla luce indipendentemente dai faraonici programmi di setacciamento.



Ipotesi di lavoro

    Per quanto ci riguarda stiamo per esporvi le risultanza di una ricerca ultratentennale, che ha preso le mosse dapprima da una nostra convinzione profonda e cioè che in Natura esista ogni cosa e il suo contrario (nel caso specifico il cancro e l'anticancro) e successivamente da un’ipotesi di lavoro che abbiamo tenacemente perseguito per quasi sette lustri.



    Per una serie di circostanze che qui sarebbe lungo e oltretutto inutile descrivere, polarizzammo inizialmente la nostra attenzione su una pianta erbacea, una scrofuliariacea, che nasce spontanea in molti nostri prati. Da questa pianta, la Linaria vulgaris, potemmo in quel tempo isolare un principio attivo che favorisce la crescita dei tumori ed un altro principio attivo che la inibisce.

    Ci chiedemmo, allora, quale fosse il "significato filosofico" della presenza di una sostanza antineoplastica in un vegetale… Nel vegetale da noi studiato e nei vegetali da altri studiati, come il Colchicum autunnale, la Vinca rosea o il Podophyllum pelpatum.

    Quale poteva essere il "senso biologico" della contemporanea presenza in uno stesso organismo di due sostanze ad azione nettamente contrapposta?

    A noi piacque pensare, ipotizzare, credere che le due sostanze servissero alla Linaria vulgaris, la prima per favorire l’accrescimento, l’altra per inibirlo, una volta che la pianta ha raggiunto il suo status adulto.

    Seguendo questa linea di pensiero, in tutti i vegetali dovrebbero coesistere due sostanze, una che favorisce l’accrescimento evolutivo della pianta, l’altra che lo inibisce ad accrescimento ultimato. Non tutte le molecole ad azione antagonista, estratte dalle piante, possono però essere utilizzate in terapia: solo alcune, in virtù del loro peso molecolare, della loro struttura spaziale, della loro carica elettrica sono in grado di interferire con le cellule animali ed, in particolare, con le cellule neoplastiche.

    Questa semplice ipotesi di lavoro soddisfaceva la nostra fantasia. Ci mettemmo subito all’opera con lo scopo di inventare i metodi chimici validi alla separazione della miriade di sostanze presenti in un vegetale ed all’isolamento delle sole due sostanze che ci interessavano.

    Una volta messe a punto le metodiche di estrazione e separazione, siamo passati ad esaminare piante di specie diversa, praticando estrazioni sia sulla pianta intera che su parti di essa come radici, foglie, fiori, bacche o frutti.

    Questo lavoro è stato lungo e complesso in quanto, se è vero che talora ci siamo imbattuti in sostanze capaci di attività antineoplastica, è pur vero che molto spesso abbiamo dovuto abbandonarle o perché ci era stato difficile stabilire per la pianta di origine l’epoca precisa di raccolta che ci assicurasse una resa costante in principio attivo o perché per alcune piante esistevano difficoltà pratiche di approvvigionamento, o, infine, perché da alcune di esse si isolavano principi attivi insolubili in acqua e quindi non utilizzabili in terapia se non attraverso complesse e talora non facili salificazioni.

    Questa fase della ricerca si è ininterrottamente dipanata a partire dal 1958 a tutto il 1988.

    Solo nel 1989 abbiamo avuto l’opportunità di studiare alcune bacche o frutti che, pur provenendo da piante di specie diversa, erano in grado di fornirci dei principi attivi standardizzabili, consentendoci di stabilire con esattezza l’epoca di raccolta della droga ed i vari procedimenti chimici di estrazione. Infine, cosa ancora più importante, detti principi attivi sono risultati solubili in H2O e quindi facilmente utilizzabili in terapia.

Caratteristiche chimiche
e fisico-chimiche
delle sostanze in argomento

    Siamo, perciò, ora in grado di sottoporre alla vostra attenzione i risultati ottenuti da due sostanze in progredita fase di studio. Trattasi di una sostanza antineoplastica estratta da bacche di Pittosporum Tobira, che d’ora in poi chiameremo sostanza CIDI, e di una sostanza estratta da bacche di Chamaerops Excelsa, che d’ora in poi chiameremo DEGU.

    Pittosporum Tobira, così detta dalla polpa resinosa che racchiude i semi (gr. pitta = pece e sporo = seme), è una pianta ornamentale sempreverde originaria dell’Estremo Oriente, che si è facilmente acclimatata nelle nostre regioni, tanto da essere particolarmente diffusa sulle coste e nei centri balneari in virtù della sua resistenza alla salsedine. In primavera produce fiori molto profumati.

    Chamaerops Excelsa è anch’essa una pianta ornamentale, appartenente alla famiglia delle Palme. In Italia è largamente rappresentata nelle zone a clima temperato, come ad esempio, le località rivierasche del lago di Garda.

    Non ci si meravigli del fatto che noi si presenti contemporaneamente due principi attivi dotati di azione antitumorale isolati da due piante di specie diversa: ciò, mentre da una parte conferma la giustezza della nostra primitiva ipotesi di lavoro, dall’altra ci sprona a continuare per la fertile strada intrapresa, potendo ormai ragionevolmente congetturare che essa condurrà noi o altri ad allungare, forse senza limiti ed in tempi brevi, l’elenco dei farmaci anticancerosi.

    Tornando alle nostre prime due sostanze, di pare, comunque, doveroso precisare che gli studi su CIDI sono attualmente in uno stadio di elaborazione più avanzato rispetto a DEGU.

    CIDI e DEGU provengono da mondi lontani, eppure presentano caratteristiche strutturali e comportamentali simili. Le sostanze sono state ottenute sotto forma di polvere, solubilissima in acqua. Dal punto di vista chimico sono sostanze organiche appartenenti al gruppo dei glucosidi.

    Mediante approfondite metodiche quali l’analisi centesimale, la cromatografia in HPLC, lo spettro all’ultravioletto, lo spettro all’infrarosso e la risonanza magnetica nucleare, abbiamo potuto estrapolare utili elementi atti alla identificazione delle loro impronte digitali dal punto di vista chimico (tab. 1).

 
 
    Le due sostanze per le quali sono ora in corso le procedure atte a definire la struttura chimica, sono state oggetto, separatamente, prima di un brevetto italiano, quindi di brevetto internazionale.

    La DL50 acuta per via intraperitoneale nel topo Swiss è di 25,0 mg/kg per la sostanza CIDI; maggiore di 2000 mg/kg per la sostanza DEGU.

    Facendo astrazione da un’analisi dettagliata dei dati esposti in tabella, che dimostrano che le due sostanze sono chimicamente diverse, a noi interessa invece sottolineare i loro punti in comune.

    Innanzitutto ci troviamo di fronte a due composti chimici ternari, contenenti cioè carbonio, idrogeno e ossigeno. Questa particolarità a noi sembra importante, in quanto tra la trentina di farmaci antineoplastici noti, solo uno di essi, la Mitramicina, è costituito da una molecola contenente soltanto, C, H e O: si dà il caso che questa sostanza sia un antibiotico e che, quindi, sia anch’essa di estrazione naturale.

    Ambedue le nostre sostanze sono solubilissime in acqua. Il loro spettro IR mostra bande analoghe riferentesi ai gruppi OH, CH3 e CH2 che, per entrambe si situano tra i 3400 e i 2900 cm – 1, differenziandosi invece completamente per bande riferibili ad altri gruppi, come  C = O,  C = C  e ancora  CH3, e, per ritrovare, infine, un’identità delle bande alla lunghezza d’onda di 1380 per CH3, 1250 per OH e intorno ai 1050 per C-O. I massimi di assorbimento all’UV si aggirano per ambedue le sostanze, tra i 203 e i 204 nm. L’HPLC dimostra che i picchi principali, corrispondenti alla massima concentrazione del principio attivo, si aggirano intorno ad RT, sicuramente non identici, ma di certo molto vicini.



Attività biologica in vitro e in vivo

    In vivo, sono state impiegate dosi variabili da 1 a 7 mg/kg per CIDI e da 100 a 400 mg/kg per DEGU. Come detto, le due sostanze, pur provenendo da piante diverse e soprattutto da piante di specie diversa, pur essendo chimicamente diverse e quindi usate a dosi diverse, dimostrano tuttavia un’imprevedibile e sconcertante similarità dal punto di vista comportamentale, tanto che d’ora in poi descriveremo come comuni le fenomenologie che abbiamo riscontrato.

    Al fine di rilevare la potenziale citotossicità delle due sostanze, esse sono state sottoposte all’"Agar overlay test" su monostrato di cellule fibroblastiche di topo L929. Il test è risultato negativo e quindi non sono citotossiche.

    Le due sostanze, inoltre, non determinano alcun danno cromosomico come dimostrano i "Micronucleus test" praticati sul midollo osseo di topi trattati con alte dosi di principio attivo e quindi le sostanze non sono genetossiche.

    L’"Ames test", in base al quale è possibile rilevare un’attività mutagena, non ha indotto significativi incrementi nel numero delle revisioni (mutazioni) in ceppo mutante di Salmonella Typhimurium e quindi le sostanze non hanno azione teratogenica.

    E’ appena il caso di accennare che le tre prove suindicate sono state condotte sia in presenza di controlli negativi, che in presenza di controlli positivi.

    Dal punto di vista istologico si sono studiate le alterazioni indotte dalle sostanze su cellule EAT provenienti da topi Swiss portatori di tumore-ascite di Ehrlich al V e VII giorno di trattamento con i principi attivi.

    L’esame a fresco all’ultramicroscopio in campo oscuro ha esibito che le cellule provenienti dagli animali di controllo mostrano, come di solito, una corona di microvilli sulle membrane, i granuli sono in movimento, presentano qualche immagine di pinocitosi. Sono libere e non agglutinate (fig. 2).

    Le cellule EAT degli animali trattati appaiono per lo più conglutinate. Si nota che le cellule sono circondate da un notevole numero di cellule bianche, polimorfonucleati, macrofagi, ed, in minore quantità, linfociti, che sembrano ben conservati. Le cellule EAT appaiono notevolmente danneggiate in corrispondenza della membrana citoplasmatica, che presenta spesso estroflessioni e che in alcuni casi sembra completamente disintegrata (fig. 3).

Fig. 2, 3, 4. – Vedi testo.


    L’esame microscopico degli strisci su vetrino fissati e colorati, e su sezioni semifine incluse in Epon, ha messo in evidenza che le cellule EAT degli animali di controllo si presentano, come di norma, con citoplasma intensamente basofilo e nucleo a volte mascherato dalla basofilia del citoplasma. Cariocinesi in varie fasi abbastanza frequenti (5-6%). Le cellule appaiono isolate le uno dalle altre.

    Nei vetrini degli animali trattati, le cellule EAT appaiono aumentate di volume, spesso sono conglutinate, presentano notevoli alterazioni della membrana citoplasmatica che in  alcuni casi è completamente assente, tanto da far apparire "nudo" il nucleo; hanno un citoplasma pallido, molto vacuolizzato, a nido d’ape, tanto da ricordare quello delle cellule schiumose. Il nucleo presenta alterazione dei nucleoli che sono pallidi. Assenza di cariocinesi. Vi è abbondanza di materiale citoplasmatico esocellulare (fig. 4).

    Alla misurazione micrometrica il loro diametro risulta essere di 19,2 m, mentre quello delle cellule EAT degli animali di controllo è di 12,4 m. Si nota la presenza di numerosi globuli bianchi, in specie macrofagi e linfociti, che, oltre che isolati, si dispongono spesso a stretta contiguità delle cellule neoplastiche, talora circondandole su tutta la circonferenza, non mostrando alcuna sofferenza e conservando inalterate le loro caratteristiche morfologiche e tintoriali.

    Per quanto riguarda la tipizzazione della popolazione delle cellule bianche prelevate dagli animali di controllo e da quelli trattati, ci siamo astenuti dall’indicare percentuali, anche approssimative, in quanto esistono molto spesso difficoltà insormontabili per un loro sicuro riconoscimento. Abbiamo comunque potuto rilevare che, mentre le cellule bianche provenienti dagli animali di controllo sono costituite prevalentemente da linfociti e granulociti neutrofili, quelle provenienti dagli animali trattati sono in prevalenza costituite da macrofagi e linfociti.

    D’altro canto, lo studio dei preparati istologici allestiti sui principali organi e tessuti prelevati da tutti gli animali, non ha messo in evidenza alcuna alterazione negli animali trattati. Ciò è in accordo con quanto emerso dalla tossicologia acuta e subacuta praticata su animali sani.

    L’importanza di questa constatazione è notevole perché, accanto ad organi come il fegato, il rene ed il cervello, sono stati esaminati anche tessuti come la milza, i linfonodi, il midollo osseo, le ghiandole seminali e l’intestino, che sono sede di attivo ricambio cellulare.

    Tutti questi dati, che comunque saranno oggetto di approfondimento, sembra vogliano indicare che le nostre sostanze:

a) -    manifestino sulla cellula neoplastica un’azione citolitica;
b) -    dimostrino una selettività di azione;
c) -    non interferiscano con il sistema di difesa immunitario, la cui azione sembra, peraltro esaltata.


Ciò vale a distinguerle da tutte le sostanze antineoplastiche note che o sono citotossiche o sono citostatiche, sviluppando indiscriminatamente la loro azione sia sulle cellule tumorali, che sulle cellule sane, specie se provenienti da tessuti sede di attivo ricambio cellulare.



Meccanismo di azione
e selettività di azione


    L’azione citolitica e la selettività di azione delle nostre sostanze sembra siano riportabili al fatto che la loro particolare costituzione chimica (glucosidi ternari) le rende atte a legarsi, forse con meccanismi di tipo competitivo, con i siti recettivi della membrana cellulare neoplastica, a livello della quale apportano evidenti e notevoli alterazioni strutturali fino alla sua dissoluzione.

    Perché queste condizioni siano rispettate, è necessario che esistano, nella cellula sensibile al farmaco (nel nostro caso, la cellula tumorale), sistemi biologici che la rendano "diversa" rispetto alla cellule dell’organismo ospite.

    La ricerca di queste diversità  1  7  26  27  28  29  è stato il punto cruciale di tutta la sperimentazione cancerologica, in quanto, né gli studi strutturali e ultrastrutturali, né le sofisticate tecniche biochimiche sono mai riuscite a mettere in evidenza nella cellula tumorale differenze tanto significative rispetto alla cellula normale da poter essere sfruttate ai fini di una sua aggregazione farmacologica di tipo selettivo. Tutto ciò discende dal fatto che la cellula neoplastica, è, comunque, un’emanazione, seppure anomala, delle cellule dell’organismo parassitato.



    Il fatto che solo le membrane cellulari neoplastiche, contrariamente a quelle normali, siano permeabili a questa nuova classe di sostanze antitumorali, indica che esse debbano avere, se non una diversa composizione chimica, almeno una diversa disposizione e concentrazione delle molecole glicolipidiche e gangliosidiche di superficie.

    E’, perciò, verosimile che questo nuovo gruppo di sostanze antitumorali, in virtù della loro struttura spaziale, del loro peso molecolare e della loro carica elettrica, si sostituiscano o entrino in combinazione, per affinità chimica, con le molecole glicolipidiche e fosfolipidiche di superficie della cellula tumorale, potendo apportare a carico della membrana citoplasmatica le alterazioni descritte ed essendo comunque in grado di poterla attraversare.

    Inizia così una reazione a catena che si concluderà solo con la morte della cellula tumorale.

    Il superamento della barriera di membrana, consente a questa classe di sostanze di svolgere la propria azione anche a livello di importanti organuli citoplasmatici. Vogliamo specificamente riferirci a lisosomi e cioè a quegli organuli citoplasmatici che, sotto forma di vescicole, contengono enzimi litici indispensabili ai processi digestivi endocellulari, capaci, cioè, di degradare, in ambiente acido, proteine, acidi nucleici, polisaccaridi e mucopolisaccaridi.

    De Duve ha definito i lisosomi come "vescicole suicide", in quanto se essi sono danneggiati da agenti tossici, la loro membrana diventa permeabile agli enzimi lososomiali che in breve tempo digeriscono e distruggono tutta la cellula 4.

    Lo studio ultrastrutturale delle membrane cellulari ha portato alla conclusione che esse abbiano tutte un’identica struttura ed analoga composizione, tanto che è ormai da tutti accettato il concetto di "membrana unitaria"  4  30.

    E’, perciò, evidente che le nostre sostanze sono in grado di apportare, a livello della membrana lisosomiale, con gli stessi meccanismi descritti per la membrana cellulare, le stesse alterazioni che, in ultima analisi, portano alla completa dissoluzione di essa. Una volta distrutta la membrana lisosomiale, gli enzimi litici vengono liberati nel citoplasma, digerendo e distruggendo la cellula.

    Tale, infatti, sembra essere il significato dell’intensa vacuolizzazione del citoplasma osservata nelle cellule neoplastiche degli animali trattati.

    Alla luce di quanto sopra esposto, a noi appare più aderente alla realtà, definire i lisosomi come delle vere e proprie "mine" endocellulari, capaci di esplodere e distruggere la cellula stessa una volta che le nostre sostanze attive abbiano innescato i meccanismi indispensabili che portano alla disintegrazione della loro membrana.

    Il particolare meccanismo di azione di queste sostanze citolitiche e le risultanze ottenute dal loro impiego nei tumori sperimentali degli animali, di fanno pensare ad un eventuale sinergismo d’azione con i sistemi di difesa dell’organismo parassitato dal tumore.

    Infatti, la veramente imponente mobilitazione dei macrofagi e dei linfociti osservata nei preparati allestiti sul liquido ascitico degli animali trattati, ci fa propendere per un massiccio intervento immunitario da parte dell’organismo ospite del tumore.

    E’ noto come l’immunosorveglianza dell’organismo nei riguardi delle cellule tumorali sia obnubilata, in quanto, a causa di un difetto dei meccanismi di riconoscimento, la cellula neoplastica è in grado di sfuggire ai sistemi di controllo immunitari. Ciò è reso anche possibile dal fatto che gli antigeni di membrana della cellula neoplastica sono estremamente "semplificati" a causa della modificazione e della ridistribuzione delle glicoproteine e deiglicolipidi presenti anche nelle cellule normali.

    Spesse volte, inoltre, sulla superficie delle cellule neoplastiche sono presenti i cosiddetti "antigeni embrionali", a specificità molto ampia, e comuni anche a cellule normali in attiva proliferazione e perciò non facilmente riconoscibili. D’altro canto, gli antigeni endocellulari sono immunologicamente inaccessibili  6.

    Ne consegue che per sensibilizzare e scatenare una reazione immunitaria efficace occorre un’azione lesiva vasta a livello della cellula neoplastica, come quella che appunto si verifica per effetto delle nostre sostanze attive. Queste sostanze, per il loro alto coefficiente di ripartizione nei lipidi, penetrano facilmente attraverso la membrana lipoproteica della cellula tumorale apportando in seno ad essa tutti i guasti che abbiamo descritto e che preludono alla liberazione di tutti quegli antigeni specifici che permetteranno poi al sistema immunitario di individuare e distruggere anche quelle cellule sfuggite all'azione delle sostanze stesse, attraverso la messa in linea dei suoi meccanismi di difesa sia cellulari (in primis, i macrofagi ed i cosiddetti linfociti "killers"), che umorali  1-7.

    Come detto, negli animali trattati esiste un  cospicuo aumento, sia in senso relativo che in senso assoluto, dei macrofagi e dei linfociti. Ciò è in accordo con le più recenti ipotesi circa l’identità delle cellule che determinano le reazioni tipiche dell’immunità cellulare. Secondo queste ipotesi, infatti, i macrofagi svolgono il ruolo di cellule effettrici nei riguardi delle cellule-bersaglio  8-11,  acquisendo questa proprietà in seguito a specifica attivazione da parte dei linfociti  12-18.



Attività antineoplastica
nei tumori ascitici degli animali

    L’attività chemioterapica delle nostre sostanze citolitiche è stata valutata sia nei tumori sperimentali ascitici, che nei tumori solidi.

    Prima di passare ad una, seppure sintetica, descrizione dei nostri risultati è necessaria una breve premessa che giustifichi l’uso, da parte nostra, di un nuovo parametro di valutazione dell’azione delle nostre sostanze in oncologia sperimentale.

    Finora, in mancanza di farmaci selettivi, la terapia antiblastica si è avvalsa, di sostanze che manifestano citotossicità notevole, sia sulle cellule tumorali che sulle cellule normali dell’organismo ospite, agendo indiscriminatamente su tutte e sfruttando soprattutto la maggior sensibilità delle cellule in attiva mitosi.

L’azione inibitoria sul cancro si è perciò sempre accompagnata ad analoga azione inibitoria sulle cellule dell’organismo ospite in più attiva riproduzione, come le cellule midollari del sistema immunitario di difesa, le cellule dell’epitelio intestinale, delle gonadi e degli annessi cutanei.

    Per tutte queste motivazioni, le sostanze antitumorali finora usate in terapia umana non sono mai state in grado di risolvere da sole il problema del cancro.

    Anche in oncologia sperimentale, dette sostanze, pur essendo talora impiegate a dosi che rasentano la LD50 acuta, riescono a prolungare il tempo medio di sopravvivenza degli animali trattati rispetto ai controlli, ma quasi mai riescono a distruggere il tumore trapiantato fino al punto da determinarne il rigetto, promuovendo di conseguenza la guarigione e la sopravvivenza definitiva degli animali trattati  19-22.

    Queste particolari condizioni operative hanno portato alla conclusione che il più importante parametro per valutare l’effetto di un farmaco antiblastico possa essere costituito dal semplice rapporto tra il tempo di sopravvivenza medio degli animali trattati e il tempo medio di sopravvivenza degli animali di controllo o T/C.

    Tale rapporto, universalmente accettato, è stato, fino ad ora, l’unico dato di confronto possibile.

    L’assenza di animali trattati e sopravvissuti (SPV) al tumore trapiantato, ha impedito di ricorrere a criteri di valutazione più sottili, ampiamente usati in farmacologia, come, ad esempio, il rapporto esistente tra l’attività di una determinata sostanza e la sua tossicità, allo scopo di ponderarne la maneggevolezza e la selettività di azione. Detto rapporto, conosciuto come "indice chemioterapico", è tanto più alto quanto più è affidabile da sostanza in esame e viene espresso in valori statistici medi dei due effetti, l’attività e la tossicità.

    L’indice chemioterapico 50

    Dose letale 50
=  _________________

   Dose efficace 50

rappresenta, perciò, il rapporto tra la dose che uccide il 50% degli animali trattati e quella che determina la sopravvivenza del 50% degli animali in cui si è sperimentalmente indotta la patologia da studiare.

    Ciò detto, nella tabella II,  vengono riportate le risultanze, da noi ottenute, in alcuni modelli sperimentali di tumori ascitici degli animali.

    In tabella è stato riportato l’esito degli esperimenti più significativi. Va, però, precisato che, per ogni tumore, è stato usato un largo ventaglio di dosi sì da consentire la costruzione di una curva dose/effetto: l’azione inibitrice sul tumore aumenta con l’aumentare della dose fino al punto in cui la tossicità indotta sull’ospite non diventa limitante, portando ad una inversione dei risultati.


Per quanto riguarda la curva ponderale, negli animali trattati si è sempre osservato un rapido decremento del peso nei primi 2-3 giorni di trattamento.

    Successivamente, al contrario dei controlli, dove l’aumento del peso è notevole e costante fino alla fase pre-terminale, l’incremento in peso degli animali trattati non si è mai discostato dall’incremento in peso di animali sani di controllo in accrescimento evolutivo.

    In tabella i risultati sono stati messi a confronto con quelli ottenuti da A. Di Marco et al. negli stessi tumori, usando la Daunoblastina, attualmente riconosciuto come farmaco leader nella terapia antitumorale 22.

    Prescindendo da tutti i dati indicati, un rapido sguardo alle caselle indicanti le percentuali di mortalità e di sopravvivenza definitiva, ci rende rapidamente edotti delle differenze esistenti. Allo stesso modo a noi è stato possibile calcolare in tutti gli esperimenti l’indice chemioterapico, non determinabile per la sostanza di confronto.

    In particolare, nel tumore ascite di Ehrlich, con CIDI, abbiamo ottenuto una sopravvivenza definitiva del 25% degli animali trattati per via intraperitoneale ed una sopravvivenza definitiva nel 100% degli animali, quando sono stati trattati per via sottocutanea con iniezione unica.

    Nel Sarcoma 180 abbiamo registrato, con CIDI,  il 70% di sopravvivenza negli animali trattati per via intraperitoneale ed ancora il 100% di sopravvivenza quando il trattamento è stato condotto per via sottocutanea in unica somministrazione. Nello stesso tumore il trattamento intraperitoneale con DEGU ha dato luogo ad una sopravvivenza definitiva del 50% degli animali.

    Nel Sarcoma di Yoshida, CIDI, usato per via endoperitoneale, ha provocato il rigetto del tumore e la sopravvivenza definitiva degli animali nel 100% dei casi.

    Al contrario, la sostanza di paragone e cioè la Daunoblastina, pur riuscendo a prolungare il tempo di sopravvivenza medio degli animali trattati rispetto ai controlli, non è stata mai in grado di salvare un solo animale dal tumore, tanto che si è avuto il 100% di mortalità in tutti i tumori ascitici testati.


 









    Indipendentemente da queste considerazioni, a noi sembra indispensabile sottolineare che l’azione inibitoria delle nostre sostanze sui vari modelli presi in esame si è manifestata non solo quando i principi attivi sono stati somministrati per via endoperitoneale (a diretto contatto con le cellule tumorali), ma anche quando essi sono stati inoculati nell’animale per via sottocutanea (perciò non a stretto contatto con le cellule neoplastiche), in sede lontana dal tumore.

    Un’unica, anche se massiccia, somministrazione delle sostanze attive, per via sottocutanea è capace di svolgere una drastica azione destruente sulle cellule tumorali ascitiche, tanto da determinare la loro distruzione, il rigetto del tumore e la sopravvivenza degli animali nel 100% dei casi.



Chemioimmunoterapia dei tumori.

    L’alto numero di animali trattati e sopravvissuti ai tre tumori ascitici presi in considerazione, ci ha permesso di architettare una serie di originali sperimentatori sulla chemioimmunoterapia dei tumori.

    In sintesi, si è voluto verificare se negli animali trattati e sopravvissuti definitivamente al primo trapianto di tumore, si fosse posto in essere un movimento immunitario capace di determinare un effetto inibitorio nei confronti di un nuovo reimpianto di cellule tumorali, non seguito da alcun trattamento; valutando possibilmente sia l’entità che la natura di questa eventuale risposta immunitaria.

    Il disegno sperimentale comprendeva, perciò, oltre che l’osservazione di tutti gli animali impiegati, anche lo studio di preparati istologici praticati sul liquido di lavaggio peritoneale di appositi gruppi di controllo, allo scopo di individuare la qualità di una possibile risposta dei meccanismi di difesa dell’ospite.

    I protocolli sperimentali relativi a questo studio (tab. III), ci permettono di affermare:

1) -    il reinnesto del tumore, negli animali sopravvissuti al primo trapianto e non più trattati, viene sistematicamente rigettato, indipendentemente dal numero delle cellule neoplastiche reinoculate e dal tempo trascorso tra il I e il II trapianto. Fa eccezione il sarcoma-ascite di Yoshida dove appare suggestiva l’ipotesi che, forse a causa di un minore potere antigenico di questo tipo di cellula neoplastica, si determini un progressivo abbassamento delle difese immunitarie man mano che ci si allontana dall’epoca del primo trapianto. Solo questo potrebbe essere il senso del rigetto del reimpianto negli animali reinoculati a due mesi dal primo trapianto e, al contrario, del conseguente sviluppo del tumore negli animali ritrapiantati dopo 5 mesi dal primo trapianto;



2) -    il rigetto del tumore, nell’animale SPV, è perciò legato ad un massiccio intervento del sistema immunitario di difesa, che è stato sensibilizzato dalla messa in circolo di antigeni tumore-specifici liberati dalla cellula cancerosa per effetto dell’azione lesiva dei principi attivi durante il primo trattamento;

3) -    al contrario di quanto avviene negli animali nel corso del trattamento farmacologico, dove l’impiego difensivo dell’ospite si attua attraverso la messa in atto di una reazione immunitaria di tipo cellulare, i meccanismi che presiedono al rigetto del tumore reimpiantato in animali già trattati e sopravvissuti, sono prevalentemente, se non esclusivamente, di tipo umorale.

Queste considerazioni aprono la porta ad affascinanti ipotesi applicative nella prevenzione e nella terapia dei tumori umani.

Il disegno sperimentale comprendeva, perciò, oltre che l’osservazione di tutti gli animali impiegati, anche lo studio di preparati istologici praticati sul liquido di lavaggio peritoneale di appositi gruppi di controllo, allo scopo di individuare la qualità di una possibile risposta dei meccanismi di difesa dell’ospite.

    I protocolli sperimentali relativi a questo studio (tab. III), ci permettono di affermare:

1)    -    il reinnesto del tumore, negli animali sopravvissuti al primo trapianto e non più trattati, viene sistematicamente rigettato, indipendentemente dal numero delle cellule neoplastiche reinoculate e dal tempo trascorso tra il I e il II trapianto. Fa eccezione il sarcoma di Yoshida dove appare suggestiva l’ipotesi che, forse a causa di un minore potere antigenico di questo tipo di cellula neoplastica, si determini un progressivo abbassamento delle difese immunitarie man mano che ci si allontana dall’epoca del primo trapianto. Solo questo potrebbe essere il senso del rigetto del reimpianto negli animali reinocolati a due mesi dal primo trapianto e, al contrario, del conseguente sviluppo del tumore negli animali ritrapiantati dopo 5 mesi dal primo trapianto;

2)     - il rigetto del tumore, nell’animale SPV, è perciò legato ad un massiccio intervento del sistema immunitario di difesa, che è stato sensibilizzato dalla messa in circolo di antigeni tumore-specifici liberati dalla cellula cancerosa per effetto dell’azione lesiva dei principi attivi durante il primo trattamento;

3)    - al contrario di quanto avviene negli animali nel corso del trattamento farmacologico, dove l’impiego difensivo dell’ospite si attua attraverso la messa in atto di una reazione immunitaria di tipo cellulare, i meccanismi che presiedono al rigetto del tumore reimpiantato in animali già trattati e sopravvissuti, sono prevalentemente, se non esclusivamente, di tipo umorale.

Queste considerazioni aprono la porta ad affascinanti ipotesi applicative nella prevenzione e nella terapia dei tumori umani.


 







 
Attività antineoplastica in vivo
nei tumori solidi

    Per quanto riguarda i    tumori solidi, lo screening è stato effettuato su tre neoplasie, il Lewis Lung Carcinoma, il melanoma solido e l’epatoma di Morris. Sono state usate tattiche terapeutiche diverse, rapportabili, in ultima analisi, alla più lenta evoluzione di questi tumori rispetto a quelli ascitici (tab. IV, V, VI).

    Nei tre modelli sperimentali le sostanze attive hanno manifestato un effetto inibitorio pari a quello riscontrato nei tumori ascitici.

    Nel carcinoma di Lewis, le nostre sostanza hanno determinato un notevole incremento del tempo medio di sopravvivenza degli animali trattati sia nei confronti dei controlli negativi che nei confronti di controlli positivi.

    In questo severo tumore sperimentale, secondo i protocolli di screening dell’Istituto Nazionale del Cancro di Bethesda, vengono considerate valide le sostanze che percentualmente diano un T/C > 125: contro un valore di 156,17 della ciclofosfamide (farmaco usato come controllo positivo), abbiamo ottenuto valori di 148,76 per CIDI alla dose di 1 mg/kg; di 156,79 per DEGU usato alla dose di 200 mg/kg e infine per DEGU, somministrato alla dose di 400 mg/kg, abbiamo ottenuto il valore di 141,98 nel 90% dei casi e la sopravvivenza definitiva nel 10% degli animali trattati.

    Nel melanoma solido, con CIDI, è stato messo in evidenza uno stretto rapporto tra la dose impiegata e l’entità della distruzione della popolazione neoplastica ottenuta.

    Infatti, il peso del tumore, escisso dagli animali al XXII giorno dall’inizio del trattamento, ha evidenziato un notevole decremento di esso negli animali trattati in tutte e tre le dosi impiegate, ottenendosi la massima azione alla dose intermedia di 7 mg/kg/die, con una differenza percentuale in peso tra i controlli e i trattati di 50,57.

    In altre parole il peso del tumore degli animali trattati corrisponde esattamente alla metà di quello dei controlli.

    Nell’epatoma di Morris, quando la sostanza è stata iniettata in sede di tumore, ha determinato la necrosi colliquativa dello stesso; quando è stata somministrata per via sottocutanea in dosi massicce e ad intervalli di tempo regolari (ogni 7 giorni per 5 volte), ha permesso di ottenere, nel 100% degli animali trattati, il rigetto del tumore e quindi la sopravvivenza definitiva degli animali stessi.

    I tumori solidi sono in genere considerati come il più difficile banco di prova della chemioterapia antineoplastica. Se è dimostrato, infatti, che la cellula cancerosa è tanto più maligna quanto più ha perso la possibilità di contatto e la capacità di organizzarsi in tessuti (come nei tumori ascitici), è altrettanto dimostrato che quando essa si comporta meno malignamente e riesce ad organizzarsi in tessuti, anche se disordinati e privi di funzione (come nei tumori solidi), il vantaggio terapeutico che ne dovrebbe residuare viene annullato o addirittura trasformato in svantaggio dal fatto che varia la lunghezza del suo ciclo mitotico.

 

 
    Nei tumori solidi, abitualmente, il ciclo micotico cellulare è più lungo e quindi l’evoluzione del tumore è più lenta: le cellule tumorali, dal punto di vista replicativo, si avvicinano a quelle dei tessuti normali in attiva e rapida mitosi, con la conseguente difficoltà da parte dei farmaci antineoplastici tradizionali (agendo essi soprattutto su cellule in rapidissima moltiplicazione) di svolgere una qualsiasi azione di tipo selettivo. In queste condizioni l’entità della distruzione operata da detti farmaci sul tessuto neoplastico è quasi pari a quella apportata a carico di tessuti come il midollo osseo, le cellule seminali, l’epitelio intestinale e gli annessi cutanei, con l’inevitabile conseguenza che, quando il paziente neoplastico non muore di tumore, soccombe a causa degli effetti tossici dei farmaci antitumorali.

    Questa inconfutabile realtà ha fatto sì che la chemioterapia antiblastica sia ancora oggi considerata, sia dai clinici che dai pazienti, dopo la chirurgia e la terapia radiante, come ultima spiaggia, l’ultimo estremo tentativo di salvezza.

    Eppure queste sostanze dimostrano di possedere una qualche azione, anche se non risolutiva, in alcuni tumori umani, come le leucemie, ed in alcuni modelli sperimentali di tumori ascitici. Sono i tumori dove il ciclo mitotico cellulare è più breve: ad esempio, 18 ore nell’adenocarcinoma ascitico di Ehrlich e appena 12 ore nella leucemia murina L1210.

    L’insuccesso terapeutico risulta plateale quando si tenta di trattare con farmaci, privi di alcuna selettività di azione e dotati soltanto di capacità aggressiva nei confronti di cellule in attiva riproduzione, i tumori solidi sia sperimentali che umani.

    Ove si consideri che il ciclo mitotico di alcuni tumori umani è abbastanza lungo (110 ore per il carcinoma dell’endometrio; 120 ore per il carcinoma ovarico;  72 ore per quello dello stomaco; 92 ore per il linfosarcoma) e che, nel contempo, la durata media di vita di alcune cellule normali è molto breve (leucociti neutrofili da 7,2 ore a 326 ore; linfociti da 1 a 720 ore; piastrine ~ 240 ore; epitelio intestinale da 48 a 96 ore) e che, infine, la cronologia maturativa di alcuni di questi elementi è molto corta (96-120 ore per gli eritrociti e circa 336 ore per i leucociti), si può ben comprendere come qualsiasi agente antiblastico non selettivo non abbia alcuna possibilità di risolvere il problema del cancro. Una, seppur drastica, azione di queste sostanze sulle cellule neoplastiche si accompagnerebbe, sempre ed indiscriminatamente, ad un altrettanto drastica distruzione di cloni cellulari normali precipuamente deputati alla difesa dell’organismo, non potendosi scindere l’effetto citotossico sulla cellula tumorale dall’analogo effetto su cellule normali altamente specializzate.

    E’, perciò, altrettanto chiaro che il successo terapeutico da noi registrato sia nei tumori sperimentali di tipo ascitico che nei tumori di tipo solido, sia soprattutto correlato alla selettività di azione delle sostanze impiegate.

    Pur rimanendo inalterata la strategia, abbiamo comunque dovuto adattare la tattica terapeutica alle diverse condizioni operative imposte da differenti cronologie di replicazione cellulare. Ce lo ha consentito una certa elasticità di impiego delle sostanze attive, derivante da una accettabile indice chemioterapico.


    Tutto ciò in virtù e per effetto di sostanze che non inibiscono, ma anzi sembrano esaltare i poteri di difesa dell’organismo, riuscendo a ripristinare la vigilanza immunitaria anche nei confronti della cellula neoplastica con i meccanismi altrove illustrati e probabilmente partecipando in proprio ad una vera e propria stimolazione del sistema immunitario di difesa per effetto della loro stessa struttura chimica: è, infatti, accertato che alcuni glicolipidi, del gruppo degli sfingoglicolipidi neutri (ai quali, appunto, appartengono le nostre sostanze), svolgono importanti attività immunologiche.

    Trasferendo questi concetti nel campo della chemioterapia dei tumori umani, il successo sarà assicurato se verrà praticata un’attenta analisi del ciclo mitotico dei vari tipi istologici di tumore da trattare, sì da sincronizzare i tempi di intervento, valutando accuratamente sia la durata dell’azione farmacologica che il numero e l’entità delle dosi.



Riassunto.

    La ricerca oncologica sperimentale è la fucina di nuove armi contro il cancro.
    Due nuove sostanze ad azione antineoplastica sono state isolate dall’Autore da piante farmacologicamente sconosciute.
    Viene illustrata l’ipotesi di lavoro che ha permesso di giungere ad esse; si discute, altresì, sul loro presumibile meccanismo di azione e sulla loro capacità selettiva nei confronti della cellula tumorale. Vengono, infine, esposti i risultati ottenuti in sei modelli di tumore sperimentale degli animali.
    Sia nei tumori ascitici, che nei tumori solidi, ambedue le sostanze hanno dimostrato un’efficacia che non ha l’eguale nei chemioterapici antitumorali finora noti e usati in terapia umana.




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